膜磷脂的實驗原理

實驗原理

膜中脂類的主要組分是磷脂和膽固醇，磷脂為含磷酸與氨堿的單脂衍生物，可分甘油磷脂及鞘氨醇磷脂兩類，它們在生命活動中有重要作用。

用甲醇-Trichloromethane可將生物膜中的脂類組分提取出來。

1膜脂類的提取

  將冰凍干燥的膜制品總重量的一半懸浮于0.8ml等滲的磷酸鹽緩沖液中，加3ml Trichloromethane:甲醇，蓋上試管塞，劇烈振蕩少1min，另外，再加1mlTrichloromethane振蕩1min,后加1ml水振蕩1min。用臺式離心機低速離心5min,在離心管里分相，緩緩地吸去上相，用細頭滴管穿過兩相界面處變性蛋白的薄層，吸出下相液，轉(zhuǎn)移到一個已知重量的小燒杯內(nèi)，置真空干燥器內(nèi)，用水泵抽氣，使溶液蒸發(fā)至干。稱重。記錄脂類抽提物的重量。

2. 磷脂的分析

1、硅膠板的規(guī)格及制作方法：準(zhǔn)備幾塊15cm×15cm的玻璃板，洗凈。烘干或滴上幾滴乙醇，用清潔的紗布擦干。

   取3g硅膠H-堿式碳酸鎂混合物或硅膠H-堿性硅酸鎂混合物，置于水平臺面上，使其自然干燥，然后放在110℃烘箱內(nèi)活化30min,貯于真空干燥器內(nèi)備用。

2、點樣：用200µLTrichloromethane-甲醇溶解2mg干燥的脂類。取100µL溶解的樣品溶液，點在距板的邊緣約2cm處薄層板的一個角上，點樣的面積要小，待樣品干燥后再點一次，如此重復(fù)。

另取一塊薄層板 ，依同樣位置點上磷脂的標(biāo)準(zhǔn)樣品混合液。

3、展層：采用傾斜上行法展層。展層缸內(nèi)新配制的溶劑系統(tǒng)平衡，進行雙相層析。

每相展層約需2h，當(dāng)溶劑前沿距板的頂端2~3cm時，取出薄層板，用鉛筆畫出溶劑前沿位置，干燥。一相展層后，取出，在空氣中干燥約15min，若空氣濕度太大時，則須在放有硫酸干燥哭喊內(nèi)干燥0.5h。

4、顯色及定位：將干燥后的薄層板放入碘缸內(nèi)，蓋好。升華的碘與磷脂發(fā)生加成反應(yīng)，而使磷脂的斑點呈現(xiàn)黃色或棕色。

斑點顯現(xiàn)后，參考磷脂標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對位置及Rf值鑒別紅細胞膜中含有那幾種磷脂。