堿性磷酸酶的分離提取及比活力的測定原理

實驗原理

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase EC 3.1.3.1簡稱為ALPase）廣泛存于微生物界和動物界。ALPase能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應，產生無機磷酸和相應的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團的轉移反應，磷酸基團從磷酸酯轉移到醇、酚或糖等磷酸受體上。在磷的生物和化學循環過程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物體內ALPase與磷的代謝直接相關，參與磷與鈣物質的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化過程。ALPase的作用適PH在堿性區域，一般在PH9.0~10.5范圍內。Mg²⁺對該酶的活力有顯著的激活使用。

為了獲得好的提取效果，在酶的制備過程，特別應注意以下幾點：

1. 選取來源豐富、酶含量高的新鮮材料。提取工作應在獲得材料后立刻開始，否則應在低溫下保存。
2. 用鹽分級沉淀是一種應用非常廣泛的方法。碳酸銨是常用的鹽。操作時，要注意保持緩沖液的合適PH值和溫度。在加碳酸銨時需事先將其研細，需緩慢加入并及時攪拌溶解，盡量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面變性。鹽析生成的沉淀，要靜置20min以上，以使沉淀*，然后方可時行離心分離。
3. 有機溶劑沉淀法也常用于蛋白質的分離提純。丙酮和乙醇是使用廣泛的兩種有機溶劑。應注意在低溫下操作，緩慢加入，充分攪拌，避免局部濃度過高放出大量熱量而使酶蛋白變性。離心收集沉淀后，立即將其溶于適量緩沖液中，以避免酶活力的喪失。
4. 在酶的制備過程中，每經一步處理，都需測定酶的活力和比活力。唯有比活力提高較大，提純步聚才有效。

     酶活力的分析：通常是以對—硝基苯磷酸二納（pNPP)為底物，在PH10.1的碳酸鹽緩沖液（含2mmol/L Mg²⁺）的測活體系中檢測酶催化pNPP水解產生黃色的對硝基苯（ pNP）在405 nm處有大的吸收峰，可以根據OD_4〇5值的增加計算酶活力的大小。酶活力定義為在37℃下，以5mmol/L pNPP為底物，在pH 10.1的碳酸鹽緩沖液含2 mmol/L  Mg²⁺的測活體系中每分鐘催化產生1 mol/L pNP的酶量定為1個酶活力單位。酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位數。

蛋白質濃度的測定常采用福林-酚試劑(Folin-Phenolreagem)顯色法，詳見北京來亨科貿有限責任公司技術文章。